细胞爬片制作全过程
细胞爬片是一种重要的技术，用于将细胞培养在固定的表面上，通常是玻璃或塑料片。通过使细胞附着和生长在这些表面上，研究人员可以观察和分析细胞的形态、运动方式以及细胞之间的相互作用。这种方法特别适用于体外实验，因为它可以排除体内环境中的多种干扰因素，使得对细胞进行各种实验干预处理更为方便和精确。
我们在做免疫荧光（IF）、原位杂交（FISH）、凋亡检测（TUNEL）等实验时，都需要制备细胞爬片，而爬片质量会影响到最后的图片呈现效果以及实验数据的精准性。本期细胞学堂为大家整理了细胞爬片的制作步骤及注意事项，帮助您快速上手开展实验。
片准备步骤概述：
1. 选择合适的爬片大小：
· 根据实验的需求选择合适的玻片大小和材质，确保能够支持你后续实验的操作和分析要求。
2. 浸酸处理：
· 使用5%稀盐酸浸泡过夜，确保每片爬片都能够充分接触到酸液，以去除表面的污渍和杂质。
3. 冲洗步骤：
· 第二天使用自来水冲洗20次，然后用三蒸水冲洗2次，这些步骤有助于彻底清除残留的酸液，避免对细胞和实验的干扰。
4. 乙醇浸泡：
· 将处理过的爬片置于无水乙醇中浸泡过夜，这一步骤有助于去除脂类污渍，确保爬片表面干净。
5. 长期保存：
· 将爬片存放在75%乙醇中长期保存备用，这样可以避免爬片受到污染，并且无需进行高压灭菌处理。
6. 使用前准备：
· 在使用时，使用酒精灯对爬片进行烘烤，确保爬片干燥并且消除可能存在的残留乙醇。
7. 放入孔板：
· 最后，将处理好的爬片放入孔板中，准备进行后续的细胞培养或实验操作。
这些步骤和注意事项确保了爬片在实验中的质量和可靠性，为后续的细胞培养和分析提供了一个良好的基础。
细胞爬片操作步骤：
1. 收集贴壁细胞并计数：
· 首先，收集贴壁细胞（例如，从培养皿中收集已经附着在表面的细胞），然后用显微镜或自动计数器计数细胞数量。
2. 准备爬片位置：
· 在每个培养皿的孔中，先滴加少量完全培养基。这样做的目的是使爬片能够与培养皿的液体形成张力粘合在一起。接着，轻轻地放入爬片，确保没有气泡形成，以防止在加入细胞悬液时爬片漂浮。
3. 接种细胞：
· 根据实验的需求和计算出的细胞数量，将合适量的细胞悬液加入到培养皿中。这一步需要准确控制细胞的数量，以确保实验能够得到一致和可重复的结果。
注意事项
· 无菌操作：整个过程中要严格遵守无菌操作，以防止细菌或其他微生物的污染影响实验结果。
· 气泡防控：在爬片操作和细胞加入过程中特别要注意避免气泡的产生，这可能会影响细胞的均匀分布和附着。
这些步骤和注意事项能够帮助确保爬片的正确使用和细胞的良好生长状态，从而支持后续的实验操作。
在进行细胞爬片后，固定是保护细胞形态和结构的重要步骤之一。固定液的选择对后续的实验结果影响重大。以下是几种常用的固定液及其适用情况：
1. 多聚甲醛（4%）：
· 应用范围：适用于免疫电镜、免疫组化、免疫荧光和TUNEL染色等。
· 特点：能够有效地固定细胞结构，但对细胞的穿透性较差，不适合要求穿透性的实验。
2. 4% 中性甲醛（又称“10% 中性福尔马林”）：
· 应用范围：广泛用于免疫组化、免疫荧光和TUNEL染色等。
· 特点：形态结构得到较好的保留，具有较强的穿透性，有助于抗原的充分暴露，但长时间放置可能会氧化成甲酸，降低溶液的pH，可能影响染色结果。
3. 其他固定液：
· 冷丙酮和75%~95% 乙醇：通常用于特定实验要求，例如快速固定和某些特定的细胞类型。
在选择固定液时，需要考虑实验的具体要求，如对细胞形态的保留程度、穿透性的需求以及后续染色的适应性。通常，固定时间在室温下进行15至30分钟，但具体时间应根据固定液的性质和实验的具体要求来确定。
这是一个以多聚甲醛（PFA）为固定液进行细胞爬片的基本步骤。以下是每个步骤的具体内容和操作要点：
1. 准备4% 多聚甲醛（PFA）：
· 将多聚甲醛溶解在PBS中，制备成4%的固定液。
· 存储在4°C的冰箱中，并在使用前将其复温至室温。
2. PBS洗涤：
· 将培养板中的爬片用PBS轻轻洗涤，每次洗涤3分钟，共洗涤3次。
· 这一步是为了去除培养基中的细胞培养液和其他杂质，避免影响固定液的作用。
3. 固定爬片：
· 使用4% 多聚甲醛固定爬片，通常固定时间为15分钟。
· 注意，如果细胞本身带有荧光信号（例如荧光标记的蛋白），在固定过程中需要避光，以免荧光信号被破坏或受到影响。
4. Triton X-100 处理：
· 准备PBS中的透明剂 Triton X-100，浓度根据实验需要调整。
· 这一步用于增加细胞膜的通透性，有助于后续抗体或荧光染料的渗透。
5. PBS洗涤：
· 用PBS洗涤爬片，每次3分钟，共洗涤3次。
· 这一步是为了去除 Triton X-100 及其余的固定液残留物。
6. 后续实验：
· 根据具体实验需求，进行后续的免疫染色、免疫荧光染色或其他分析。
· 确保所有步骤在适当的条件下进行，以保证细胞的形态和抗原的充分暴露。
通过这些步骤，可以有效地固定细胞并为后续的实验准备好样品。
细胞爬片封片的步骤如下所述
1. 准备封片前的细胞处理：
· 根据实验需求，进行抗体孵育或核酸染色。
· 确保抗体或染料已经充分与细胞结合或标记。
2. PBS洗涤：
· 将爬片放入含有PBS的培养皿中，轻轻晃动或轻拍，使洗涤液充分覆盖细胞，并将其洗净。每次洗涤3分钟，共洗涤3次。
· 这一步是为了去除抗体孵育或染料反应后的多余物质。
3. 吸水纸吸干：
· 使用吸水纸轻轻地吸干爬片上的液体。需要小心操作，确保不损伤细胞或移除细胞。
4. 封片：
· 使用适当的封片液（例如甲醛/甘油溶液）封闭玻片和载玻片之间的空间。这一步的目的是保护细胞和维持它们的形态，使其可以长期保存以供观察和分析。
5. 封片后的处理：
· 封片后，可以在显微镜下观察，进行细胞分析或成像。
通过这些步骤，可以有效地完成细胞爬片的封片工作，确保样品的保存和后续分析的准确性。
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