细胞培养中常见的污染及解决方法
细胞培养中常见的生物污染包括细菌污染、霉菌污染、支原体污染、黑点污染、真菌污染和原生动物污染。这些污染在细胞培养中的特点及相应的解决办法如下:
1. 细菌污染
细菌在普通倒置显微镜下呈黑色和细砂状。根据感染菌的种类不同,可能会呈现不同的形状,培养液一般会变得浑浊、黄色,对细胞生长有明显影响。
解决方法:仔细检查器具的灭菌情况,确保通风时间和高压灭菌器的压力是否足够。最重要的是,与培养基接触的移液管等物品如果被污染两次,则可能会导致储存溶液也受到污染。所以一定要注意!下次使用前要检查培养基的浑浊度。此外,建议在培养基中添加抗生素。
2. 霉菌污染
正常情况下,培养基在37℃培养箱中培养两三天,在倒置显微镜下仍保持透明,无杂质。一旦出现絮状杂质,显微镜下可见丝状和团块状漂浮物,菌丝明显。此时,虽然细胞仍在生长,但它们的生命状态会在长时间后逐渐恶化。
解决方法:用硫酸铜溶液擦拭CO2培养箱,向托盘中加入饱和硫酸铜或消毒后加入饱和磷酸氢二钠高盐溶液,避免霉菌污染。
如果霉菌污染,暂时转移所有细胞,并立即彻底使用过氧乙酸溶液擦拭培养箱,包括层板和内壁。将过氧乙酸放在培养箱中一小时,使蒸汽扩散,待过氧乙酸气味消散后,将细胞转移到培养箱中。值得注意的是,培养箱需要每两个月定期清洗一次,尤其是在梅雨季节。用84消毒液、清水和75%酒精连续擦拭培养箱,用紫外线照射也是一种有效的方法。
为防止霉菌污染,需添加3μg/ml两性霉素、霉素抑制素、放线菌素D或青霉素链霉素。一旦被污染,就不可能恢复,即使使用上述抗生素,也没有什么区别。对于支原体污染的细胞培养,最好的选择是丢弃污染的培养物,并用使用新鲜的无支原体的储存液,彻底消毒环境。如果所有的细胞都被污染了,那可能是整个培养系统污染了。因此,必须对培养基和实验设备进行检查。如果只是个别污染,可能是操作问题,有必要注意实验操作步骤的规范。
3. 支原体污染
支原体是隐蔽的污染物,不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象,比如细胞病变和浊度或pH值变化(即使在严重污染的培养基中),这样就会导致我们产生错误的安全感。而在牛血清中,支原体是最常见的微生物之一。
解决方法:通常的过滤灭菌方法对支原体没有影响。细胞一旦被支原体污染,特别是对重要的细胞系,必须去除支原体,一般的方法有抗生素治疗、抗血清治疗和抗血清与补体联合治疗。值得注意的是,支原体最突出的结构特征是没有细胞壁。因此,它对作用于细胞壁的生物合成抗生素(如β-内酰胺类、万古霉素等)完全不敏感,并且通常对多粘菌素、利福平和磺胺类药物具有耐药性。相反,四环素类和大环内酯类抗生素对支原体的抑制作用最强,而氨基糖苷类和氯霉素的抑制作用较弱。
4.黑点污染
黑色的游动点能穿透滤膜并在空气中扩散。它们在低倍镜下显示为黑色圆点,在高倍镜下显示为可移动的黑色斑点。培养液也不浑浊,一般影响较小,因此细胞仍可使用。通常,黑点污染后,细胞生长良好,运动物体无明显增加,培养基的颜色和透明度无明显变化。在同一批血清培养的细胞中也可以发现类似的现象。
解决方法:黑点对细胞生长状态没有明显影响,细胞增殖后会自然消失,因此除了血清置换外,无需特殊处理。如果细胞可能被小的运动点污染,建议增加培养皿细胞密度,以提高细胞存活率。
5. 真菌污染
真菌污染后,培养基一般清澈,保持原色。细丝可以在显微镜下观察到。最初,一些真菌类似于死细胞碎片,但其中许多清晰可见,看起来像珊瑚,比较容易区分。此外,它们会慢慢长出细细的黑色细丝,因为它们生长得比较慢,不像细菌那样容易被发现,一旦发现培养基被污染,它们将很难存活。
解决方法:一旦被真菌污染,果断丢弃,然后对细胞房、CO2培养箱、器皿和培养基进行彻底消毒。
6.原生动物污染
原生动物污染后,细胞培养基变得轻微浑浊。在显微镜下,大量的小点来回移动。虽然此时细胞仍能生长,但繁殖速度减慢,细胞生长状态不好,边缘不清,变得不透明。原生动物与细胞形成共生关系。同时,原生动物与细胞竞争营养。这种共生现象非常普遍,但以细胞为主,因为原生动物的数量相对较少,因而对细胞的正常生长没有影响,只有当它们达到一定数量时,才最终爆发成为恶性循环。
解决方法:原生动物污染的原因有很多,如液体消毒问题、操作问题、环境问题等,如果细胞足够,果断丢弃被污染的细胞和复苏细胞。如果要保留,需要购买使用相关的灭菌试剂。