掌握细胞增殖与细胞毒性检测
CCK-8是一种高灵敏度、无放射性的比色检测法，用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数量，可替代传统的MTT法，常应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。尽管有人戏称CCK-8测细胞增殖实验只要有试剂盒就“有手就行”，但实际操作中仍有许多细节需要注意。本期细胞学堂将详细介绍CCK-8法的原理、步骤及注意事项，帮助您轻松掌握并顺利开展实验。
实验原理：其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐】，在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye），生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
这段实验操作指南详细描述了细胞增殖或细胞毒性实验的步骤和操作流程。让我来总结一下：
1. 细胞接种：
· 每个96孔板的孔中加入100 μL细胞悬液，含有约2000个细胞。留出2个空白孔作为对照组，加入同体积的培养基。孵育条件为37°C，5% CO2，培养24小时。
2. 药物处理：
· 在孵育后的细胞中，每孔加入10 μL不同浓度的药物刺激，留出2个对照组孔加入同体积的培养基。
3. 细胞培养：
· 将96孔板放回37°C，5% CO2，100%湿度的细胞培养箱中，继续孵育适当的时间，以便药物刺激细胞反应。
4. 细胞代谢活性测定：
· 每孔加入10 μL的CCK-8溶液，再次孵育1~4小时，使细胞代谢作用与CCK-8发生反应。
5. 测量吸光度：
· 使用酶标仪测定每个孔的450 nm处的吸光度（OD值），以评估细胞代谢活性。
6. 暂时存储处理：
· 如果暂时不测定吸光度，可以向每孔中加入10 μL 0.1 M HCl溶液或者1%（W/V）SDS溶液，并遮盖培养板避光，室温保存。这样处理在24小时内不会明显影响吸光度的测定结果。
7. 结果分析：
· 使用以下公式计算结果：
· 细胞存活率（%）=（ODsample - ODblank）/（ODcontrol - ODblank）× 100%
· 抑制率（%）=（ODcontrol - ODsample）/（ODcontrol - ODblank）× 100%
· 其中，ODsample为实验孔的吸光度值，ODcontrol为对照孔的吸光度值，ODblank为空白孔的吸光度值。
这些步骤提供了一个标准化的方法来评估药物对细胞生长和代谢的影响，确保实验的可重复性和结果的可比性。
注意事项
细胞种板浓度：通过查看文献确认。查看实验所用细胞别人是否使用过，找出大致范围。稀释一系列浓度种板。
贴壁生长的时间一般设置贴壁24 h，这个时间一般细胞已经贴壁完全，且对安排实验时间也方便。
加药后的孵育时间：设置时间梯度，根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。
接种时注意细胞悬液一定要混匀，避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种数孔即混匀一下。培养板周围一圈孔内的培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基或无菌PBS，而不作为指标检测孔。
CCK-8试剂加入量：按照说明书加入合适的含量。若细胞体系较大，适当增加CCK-8的量。
CCK-8试剂加入后，随着孵育时间的增加，OD值就会增大。CCK-8的最佳反应时间以显色的最佳时间为准。第一次做实验时，建议先做数孔摸索接种细胞的最佳数量和加入CCK-8试剂后的最佳孵育时间。一般情况下，白细胞较难显色，因此需要较长的CCK-8反应时间或增加细胞数量（约105个细胞/孔）。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞，在加入CCK-8孵育1~4 h后，可先从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定决定CCK-8最佳孵育时间。若显色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再测定。对于贴壁细胞，CCK-8的孵育时间一般为1~4 h，多数细胞在培养30 min左右即可肉眼观察到明显的显色反应，培养3.5~4 h左右检测效果最佳。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。
实验时尽量多设置复孔，取平均值。实验时把OD值控制在1.0左右。因人为造成的数据不稳定只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。另外实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。
CCK-8的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。含有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。
如何判定待测溶液是否有还原性？不含细胞的待测溶液孔中加入CCK-8溶液10 μL，孵育1~4 h，测定在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，说明待检测体系中存在较少的还原剂，正式检测时即可直接加入CCK-8；如果该吸光度相对较大，说明待检测体系中存在较多的还原剂，正式检测时则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基和10 μL CCK-8进行检测。
如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议设定600 nm（或600 nm以上）作为参比波长，扣除参比波长的OD值即可。
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